Finalistlere Dön

DOKTORCLUB AWARDS 2022

Yılın Doktoru Ödülleri - Yılın Yenilikçi Dahili Bilimler Doktoru Finalisti

Prof.Dr. Fatih Özaltın


Prof.Dr. Fatih Özaltın

  Yeni Bir Gen, Yeni Bir Sendrom (TRACK Sendromu)  

  İlk kez 5 yıl önce İstanbul Üniversitesi Cerrahpaşa Tıp Fakültesi Çocuk Nefrolojisi Bilim Dalı’nda, görünürde birbiriyle ilişkisi olmayan benzer fenotipte hasta bireylerin bulunduğu iki aile tanımlanmıştır. Bu ailelerden ebeveynler arasında 1.derece kuzen ilişkisi bulunan toplam 4 çocukta daha önce bilinmeyen kraniofasiyal malformasyonlar, dentisyon bozuklukları, boğuk nazone ses, santral sinir sistemi anormallikleri ve atipik hemolitik üremik sendromdan oluşan sendromik bir fenotip tanımlanmıştır.

  Bu hastalar atipik hemolitik üremik sendromunun bilinen genlerinin mutasyonları yönünden araştırılması için nefrogenetik alanında kapsamlı araştırmalar yapmam nedeniyle tarafıma danışılmıştır. Hacettepe Üniversitesi Moleküler Nefroloji Laboratuvarı’nda yaptığımız ilk analizlerde hasta bireyler atipik hemolitik üremik sendroma neden olduğu bilinen kompleman sisteminin alternatif yolağında rolü olan genlerin mutasyonları ile kompleman sisteminden bağımsız olarak hemolitik üremik sendroma neden olan DGKE mutasyonları açısından taranmıştır. Analizler sonucunda söz konusu bilinen genlerde bir mutasyon saptanmamıştır. Takibinde bu aileler fenotipten sorumlu yeni genlerin tanımlanması amacıyla bilimsel araştırmaya tabi tutulmuş bu kapsamda tüm etkilenmiş bireyler, bunların ebeveynleri ile sağlıklı kardeşlere tüm ekzom dizileme analizi yapılmıştır. Gerçekleştirilen biyoinformatik analizlerle tüm hasta bireylerde homozigot, ebeveynlerde heterozigot, sağlıklı kardeşlerde ya heterozigot ya da her iki allelin yabanıl tip olduğu tek bir varyasyon saptanmıştır o da TSEN2 geninde c.914-5T>A varyasyonudur. Sanger dizileme analizi ile doğrulanan bu varyasyonun aileler içinde hastalıkla "segrege" olduğu da gösterilmiştir. Bu varyasyonun ekzonik (kodlayıcı) bölgede olmadığı ancak kesim bölgesine (splice site) çok yakın olduğu tespit edilmiştir. İntronik bir varyasyon olduğundan fenotipten sorumlu olduğunun kanıtlanması gerekmektedir. In slico analizler bu varyasyonun patojen olduğunu ön görmüştür. Ayrıca MaxEntScan analiz programı ile kriptik bir kesim bölgesi oluşabileceği de ön görülmüştür. Hastalara ait komplementer DNA (cDNA) örneklerinde sekans analizi gerçekleştirildiğinde 3 farklı transkript olduğu belirlenmiştir. Daha ayrıntılı analize tabi tutmak için gerçekleştirilen mini gen deneyi ile TSEN2 için tanımlanan varyasyonun 3 farklı transkripte neden olduğu ortaya konmuştur: 1) Normal transkript, 2) Ekzon 9’un ekzon 11 ile devam ettiği yani ekzon 10’un atlandığı transkript, 3) Mutasyonun neden olduğu AG motifinin olması gereken yerden 3 baz önce kesim yaptığı yani kriptik bir kesim noktasının oluştuğu transkript.  Bu çalışmalar sırasında Hacettepe Üniversitesi Çocuk Nefrolojisi Bilim Dalı’nda ilk 2 ailedeki hasta bireylere çok benzeyen ve onlar gibi Güneydoğu Anadolu kökenli, ebeveynleri arasında akrabalık bulunan iki aileden iki hasta birey daha tanımlanmış ve aynı gende aynı varyasyonu homozigot olarak taşıdıkları saptanan toplamda 4 aileden 6 hasta birey sayısına ulaşılmıştır. Tüm bu bulgular hastaların kökenleri olan coğrafik bölgede bu varyasyonun “founder” mutasyon olabileceğini düşündürmüştür. Ailelerin bilinen akrabalık ilişkileri olmamakla birlikte yapılan analizler sonucunda aslında bu ailelerin birbirleriyle ilişkili oldukları; TSEN2’nin de içinde yer aldığı 4.2 Mb bir bölgeyi ortak olarak taşıdıkları gösterilerek bu ailelerin ortak bir atadan geldikleri ispatlanmıştır.   

   İnsan genomunda yaklaşık 500 adet tRNA kodlayan gen vardır. Bunlar pre-tRNA olarak transkripsiyona tabi tutulur ve olgun fonksiyonel tRNA oluşması için post-translasyonel modifikasyona uğrarlar. Bunlardan 32 tanesi antikodon kısmı üzerinde intronik kalıntılar içererek transkripsiyona uğradıklarından fonksiyonel hale gelebilmeleri için bu intronik kısımların uzaklaştırılmaları gerekir. Bu uzaklaştırma işlemi TSEN kompleks (TSEN2, TSEN34, TSEN15 ve TSEN54) tarafından gerçekleştirilir. Bu kompleks 2 yapısal 2 enzimatik alt ünite olmak üzere 4 alt üniteden oluşur ve CLP1 ile birlikte çalışarak intronik kalıntıların kesimini gerçekleştirip ekzonların 5’-3’ yönünde bağlanmasını sağlar. TSEN2 geni bu kompleksin enzimatik aktivite gösteren bölümünde yer alan TSEN2 proteinini kodlar. Dolayısıyla mutant TSEN2 geninin ürünü fonksiyonel olmayacağından mutasyona paralel olarak TSEN kompleksi fizyolojik fonksiyonunu gerçekleştiremez.  Aslında TSEN kompleksini oluşturan her bir alt ünitedeki ekzonik hipomorfik mutasyonlar daha önce pontoserebellar hipoplazi ile ilişkilendirilmiştir ancak biz ilk kez TSEN2 kesimi bozan intronik bir mutasyonun yeni bir fenotiple ilişkisini ortaya koyduk. Hastalarda saptadığımız mutasyonun sonuçları incelendiğinde normal transkript, hastaların canlı doğmasını ve yaşamasını sağlarken anormal 2 transkriptin hastalarda tanımlanan fenotiplerle ilişkili olabileceğini düşündük. Çünkü ekzon 10’un atlanması evrim boyunca korunmuş onlarca aminoasitten yoksun bir protein oluşturmakta iken alternatif kesim bölgesinin oluşması proteine 2 aminoasit ilavesiyle sonuçlanmaktaydı. Aminoasit eksikliğinin de fazlalığının da proteinin 3 boyutlu yapısını bozacağı ve fonksiyon kaybıyla sonuçlanacağını düşündük. Bu hipotezin doğruluğunu kanıtlamak için hasta bireylerde RNA sekansı yaptık ve aynı cinsiyet ve yaşta sağlıklı bireylerin RNA sekans verisiyle karşılaştırdık. Bu yolla ifadesi artan ve azalan genler ortaya konduğu gibi protein sentezinde kritik rol üstlenen ama bozuk TSEN enzimatik aktivitesi nedeniyle olgun yapıya dönüştürülemeyen 5 anormal tRNA transkripti de belirledik. Yolak analizlerinde mutasyondan etkilenen yolakların splizozom, ribozom, sinaptik vezikül döngüsü, glutamaterjik sinaps ve Hippo -YAP sinyal yolakları olduğunu net bir şekilde ortaya koyduk. Bu yolakların mutasyondan etkilendiği, fenotipte saptanan kanıtlarla da doğrulandı. Bu yolakların beyin gelişimi, yüz gelişimi, diş gelişimi, damarlarda endotel hücre homeostazı gibi birçok gelişimsel ve homeostatik mekanizmalarda rolleri olduğu daha önceki çalışmalarda gösterildiğinden bulgularımızın hastaların fenotiplerini bu yolla açıkladığı sonucuna vardık.TSEN2’de saptanan bu mutasyonun fenotipten sorumlu olduğunu ispatlamak için aynı mutasyona sahip zebra balığı modeli oluşturularak insanlardaki morfolojik bulguların eşdeğerleri zebra balığında da ortaya konarak bu mutasyonun gerçekten bu yeni sendromdan sorumlu olduğunu kanıtladık. Böylelikle bu yeni sendroma TRACK sendromu (TSEN2 Related Atypical hemolytic uremic syndrome, Craniofacial malformations, Kidney failure) ismini verdik ve tıp literatürüne kaydettik (1).

  Ancak daha cevaplanması gereken birçok soru mevcut:
1. Neden tüm hücrelerde yaygın olarak ifade edilen TSEN’in 4 alt birimindeki mutasyonlar izole pontoserebellar hipoplaziye neden oluyor
2. Bu mutasyonlar nasıl santral sinir sisteminde de sadece belli nöronları etkiliyor? 
3. Beyin malformasyonlarının ardındaki mekanizmalar nedir?
4. Bu çalışmada saptadığımız intronik mutasyon neden çok farklı bir fenotipe neden oluyor?

  Bu sorular tRNA biyolojisinin ne kadar karmaşık olduğunu da göstermektedir. tRNA biyolojisindeki bozuklukların yaygın etkilerini daha iyi anlayabilmek için öncelikli olarak aydınlatılması gereken noktalar aşağıdaki şekilde özetlenebilir: 
1. Endotel hücre hasarının mekanizması (in vitro) (tRNA-vasküler homeostaz ilişkisinin aydınlatılması)
2. Yolak analizlerinde değişiklik olduğu saptanan yolakların hayvan modellerinde moleküler düzeyde çalışılması ve değişikliklerin teyit edilmesi
3. Nöron ve endotel spesifik mRNA analizleri
4. Hastaların hücrelerindeki tRNA havuzunun niteliğinin ve dolaylı olarak protein profilinin ortaya konması ve aberan tRNA’ların hücresel düzeyde gösterilmesi, patogeneze yönelik ileri araştırmalar.

   Bu sorulara cevap bulmak için ileri çalışmaları başlattık. Bunlardan elde edilecek sonuçların tRNA biyolojisine ışık tutacak nitelikte olmasını bekliyoruz.

  1. Canpolat N, Liu D, Atayar E, Saygili S, Kara NS, Westfall TA, Ding Q, Brown BJ, Braun TA, Slusarski D, Karli Oguz K, Ozluk Y, Tuysuz B, Tastemel Ozturk T, Sever L, Sezerman OU, Topaloglu R, Caliskan S, Attanasio M, Ozaltin F.  A splice site mutation in the TSEN2 causes a new syndrome with craniofacial and central nervous system malformations, and atypical hemolytic uremic syndrome. Clin Genet. 2022 Mar;101(3):346-358.