Prof.Dr. Fatih Özaltın
Yeni Bir Gen, Yeni Bir Sendrom (TRACK Sendromu)
İlk kez 5 yıl önce İstanbul Üniversitesi Cerrahpaşa Tıp Fakültesi Çocuk
Nefrolojisi Bilim Dalı’nda, görünürde birbiriyle ilişkisi olmayan benzer
fenotipte hasta bireylerin bulunduğu iki aile tanımlanmıştır. Bu ailelerden
ebeveynler arasında 1.derece kuzen ilişkisi bulunan toplam 4 çocukta daha önce
bilinmeyen kraniofasiyal malformasyonlar, dentisyon bozuklukları, boğuk nazone
ses, santral sinir sistemi anormallikleri ve atipik hemolitik üremik sendromdan
oluşan sendromik bir fenotip tanımlanmıştır.
Bu hastalar atipik hemolitik üremik sendromunun bilinen genlerinin
mutasyonları yönünden araştırılması için nefrogenetik alanında kapsamlı
araştırmalar yapmam nedeniyle tarafıma danışılmıştır. Hacettepe Üniversitesi
Moleküler Nefroloji Laboratuvarı’nda yaptığımız ilk analizlerde hasta bireyler
atipik hemolitik üremik sendroma neden olduğu bilinen kompleman sisteminin
alternatif yolağında rolü olan genlerin mutasyonları ile kompleman sisteminden
bağımsız olarak hemolitik üremik sendroma neden olan DGKE mutasyonları
açısından taranmıştır. Analizler sonucunda söz konusu bilinen genlerde bir
mutasyon saptanmamıştır. Takibinde bu aileler fenotipten sorumlu yeni genlerin
tanımlanması amacıyla bilimsel araştırmaya tabi tutulmuş bu kapsamda tüm
etkilenmiş bireyler, bunların ebeveynleri ile sağlıklı kardeşlere tüm ekzom
dizileme analizi yapılmıştır. Gerçekleştirilen biyoinformatik analizlerle tüm
hasta bireylerde homozigot, ebeveynlerde heterozigot, sağlıklı kardeşlerde ya
heterozigot ya da her iki allelin yabanıl tip olduğu tek bir varyasyon
saptanmıştır o da TSEN2 geninde c.914-5T>A
varyasyonudur. Sanger dizileme analizi ile doğrulanan bu varyasyonun
aileler içinde hastalıkla "segrege" olduğu da gösterilmiştir.
Bu varyasyonun ekzonik (kodlayıcı) bölgede olmadığı ancak kesim bölgesine
(splice site) çok yakın olduğu tespit edilmiştir. İntronik bir varyasyon
olduğundan fenotipten sorumlu olduğunun kanıtlanması gerekmektedir. In
slico analizler bu varyasyonun patojen olduğunu ön görmüştür. Ayrıca
MaxEntScan analiz programı ile kriptik bir kesim bölgesi oluşabileceği de
ön görülmüştür. Hastalara ait komplementer DNA (cDNA) örneklerinde sekans
analizi gerçekleştirildiğinde 3 farklı transkript olduğu belirlenmiştir. Daha
ayrıntılı analize tabi tutmak için gerçekleştirilen mini gen deneyi ile TSEN2 için
tanımlanan varyasyonun 3 farklı transkripte neden olduğu ortaya konmuştur: 1)
Normal transkript, 2) Ekzon 9’un ekzon 11 ile devam ettiği yani ekzon 10’un
atlandığı transkript, 3) Mutasyonun neden olduğu AG motifinin olması gereken
yerden 3 baz önce kesim yaptığı yani kriptik bir kesim noktasının oluştuğu
transkript.
Bu çalışmalar sırasında Hacettepe Üniversitesi Çocuk Nefrolojisi Bilim
Dalı’nda ilk 2 ailedeki hasta bireylere çok benzeyen ve onlar gibi Güneydoğu
Anadolu kökenli, ebeveynleri arasında akrabalık bulunan iki aileden iki hasta
birey daha tanımlanmış ve aynı gende aynı varyasyonu homozigot olarak
taşıdıkları saptanan toplamda 4 aileden 6 hasta birey sayısına ulaşılmıştır.
Tüm bu bulgular hastaların kökenleri olan coğrafik bölgede bu varyasyonun
“founder” mutasyon olabileceğini düşündürmüştür. Ailelerin bilinen akrabalık
ilişkileri olmamakla birlikte yapılan analizler sonucunda aslında bu ailelerin
birbirleriyle ilişkili oldukları; TSEN2’nin de içinde yer aldığı
4.2 Mb bir bölgeyi ortak olarak taşıdıkları gösterilerek bu ailelerin ortak bir
atadan geldikleri ispatlanmıştır.
İnsan
genomunda yaklaşık 500 adet tRNA kodlayan gen vardır. Bunlar pre-tRNA olarak
transkripsiyona tabi tutulur ve olgun fonksiyonel tRNA oluşması için post-translasyonel
modifikasyona uğrarlar. Bunlardan 32 tanesi antikodon kısmı üzerinde intronik
kalıntılar içererek transkripsiyona uğradıklarından fonksiyonel hale
gelebilmeleri için bu intronik kısımların uzaklaştırılmaları gerekir. Bu
uzaklaştırma işlemi TSEN kompleks (TSEN2, TSEN34, TSEN15 ve TSEN54) tarafından
gerçekleştirilir. Bu kompleks 2 yapısal 2 enzimatik alt ünite olmak üzere 4 alt
üniteden oluşur ve CLP1 ile birlikte çalışarak intronik kalıntıların kesimini
gerçekleştirip ekzonların 5’-3’ yönünde bağlanmasını sağlar. TSEN2 geni
bu kompleksin enzimatik aktivite gösteren bölümünde yer alan TSEN2 proteinini
kodlar. Dolayısıyla mutant TSEN2 geninin ürünü fonksiyonel
olmayacağından mutasyona paralel olarak TSEN kompleksi fizyolojik fonksiyonunu
gerçekleştiremez. Aslında TSEN kompleksini oluşturan her bir alt
ünitedeki ekzonik hipomorfik mutasyonlar daha önce pontoserebellar hipoplazi
ile ilişkilendirilmiştir ancak biz ilk kez TSEN2 kesimi bozan intronik bir
mutasyonun yeni bir fenotiple ilişkisini ortaya koyduk. Hastalarda saptadığımız
mutasyonun sonuçları incelendiğinde normal transkript, hastaların canlı
doğmasını ve yaşamasını sağlarken anormal 2 transkriptin hastalarda tanımlanan
fenotiplerle ilişkili olabileceğini düşündük. Çünkü ekzon 10’un atlanması evrim
boyunca korunmuş onlarca aminoasitten yoksun bir protein oluşturmakta iken
alternatif kesim bölgesinin oluşması proteine 2 aminoasit ilavesiyle
sonuçlanmaktaydı. Aminoasit eksikliğinin de fazlalığının da proteinin 3 boyutlu
yapısını bozacağı ve fonksiyon kaybıyla sonuçlanacağını düşündük. Bu
hipotezin doğruluğunu kanıtlamak için hasta bireylerde RNA sekansı yaptık ve
aynı cinsiyet ve yaşta sağlıklı bireylerin RNA sekans verisiyle karşılaştırdık.
Bu yolla ifadesi artan ve azalan genler ortaya konduğu gibi protein sentezinde
kritik rol üstlenen ama bozuk TSEN enzimatik aktivitesi nedeniyle olgun yapıya
dönüştürülemeyen 5 anormal tRNA transkripti de belirledik. Yolak analizlerinde
mutasyondan etkilenen yolakların splizozom, ribozom, sinaptik vezikül döngüsü,
glutamaterjik sinaps ve Hippo -YAP sinyal yolakları olduğunu net bir şekilde
ortaya koyduk. Bu yolakların mutasyondan etkilendiği, fenotipte saptanan
kanıtlarla da doğrulandı. Bu yolakların beyin gelişimi, yüz gelişimi, diş
gelişimi, damarlarda endotel hücre homeostazı gibi birçok gelişimsel ve
homeostatik mekanizmalarda rolleri olduğu daha önceki çalışmalarda
gösterildiğinden bulgularımızın hastaların fenotiplerini bu yolla açıkladığı
sonucuna vardık.TSEN2’de saptanan bu mutasyonun fenotipten sorumlu
olduğunu ispatlamak için aynı mutasyona sahip zebra balığı modeli oluşturularak
insanlardaki morfolojik bulguların eşdeğerleri zebra balığında da ortaya
konarak bu mutasyonun gerçekten bu yeni sendromdan sorumlu olduğunu kanıtladık.
Böylelikle bu yeni sendroma TRACK sendromu (TSEN2 Related Atypical hemolytic
uremic syndrome, Craniofacial malformations, Kidney failure) ismini verdik ve
tıp literatürüne kaydettik (1).
Ancak daha cevaplanması gereken birçok soru mevcut:
1. Neden tüm hücrelerde
yaygın olarak ifade edilen TSEN’in 4 alt birimindeki mutasyonlar izole
pontoserebellar hipoplaziye neden oluyor
2. Bu mutasyonlar nasıl
santral sinir sisteminde de sadece belli nöronları etkiliyor?
3. Beyin
malformasyonlarının ardındaki mekanizmalar nedir?
4. Bu çalışmada
saptadığımız intronik mutasyon neden çok farklı bir fenotipe neden oluyor?
Bu sorular tRNA biyolojisinin ne kadar karmaşık olduğunu da göstermektedir.
tRNA biyolojisindeki bozuklukların yaygın etkilerini daha iyi anlayabilmek için
öncelikli olarak aydınlatılması gereken noktalar aşağıdaki şekilde
özetlenebilir:
1. Endotel hücre hasarının
mekanizması (in vitro) (tRNA-vasküler homeostaz ilişkisinin
aydınlatılması)
2. Yolak analizlerinde
değişiklik olduğu saptanan yolakların hayvan modellerinde moleküler düzeyde
çalışılması ve değişikliklerin teyit edilmesi
3. Nöron ve endotel
spesifik mRNA analizleri
4. Hastaların hücrelerindeki tRNA havuzunun niteliğinin ve dolaylı olarak
protein profilinin ortaya konması ve aberan tRNA’ların hücresel düzeyde
gösterilmesi, patogeneze yönelik ileri araştırmalar.
Bu sorulara cevap bulmak için ileri çalışmaları başlattık. Bunlardan elde
edilecek sonuçların tRNA biyolojisine ışık tutacak nitelikte olmasını
bekliyoruz.
1. Canpolat N, Liu D, Atayar E, Saygili S, Kara NS, Westfall TA, Ding Q,
Brown BJ, Braun TA, Slusarski D, Karli Oguz K, Ozluk Y, Tuysuz B, Tastemel
Ozturk T, Sever L, Sezerman OU, Topaloglu R, Caliskan S, Attanasio M, Ozaltin
F. A splice site mutation in the TSEN2 causes a new syndrome
with craniofacial and central nervous system malformations, and atypical
hemolytic uremic syndrome. Clin Genet. 2022 Mar;101(3):346-358.